关于stainingbuffer的信息
免疫染色中加入staining buffer（成分有血清和吐温）目的是为了封闭，但是具体是封闭什么？
封闭是封闭住板（或者叫空），一开始是包被，包被以后，板子仍然可以和其他的蛋白结合，比如你的一抗或者二抗，或者是要检测的抗原，而用血清（BSA,或者脱脂乳）封闭后，整个板子的空白处都可以被封闭，不能再继续结合其他的蛋白了。而封闭物不会和你的待检蛋白结合，只有你包被上的单抗（或者已知抗原）可以和待检抗原（或者一抗）结合，就可以避免待检抗原或者一抗和板子结合造成假阳性，吐温在里面只是起如花作用，改变蛋白质的亲疏睡性质，易于结合的。
流式细胞术 staining buffer 中的nan3 有什么作用
NaN3 是一种防腐剂。如果是自己配置，现用的溶液，不要加，因为毒性很大。只有商品化的大体积stock溶液中，为了防止变质，才会添加。
原位杂交的原位杂交试验
收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成） 1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。
2） 置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟
3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次
4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟
5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。
2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。
4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
2. 预杂交
1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。
2）用等体积的HYB+取代HYB－。
3）60℃水浴，预杂交4小时以上。
3. 杂交
1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..
2）60℃ 温浴过夜。
注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。 1.
1）将探针回收，放于－20C保存（通常探针可重复使用十次左右）。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。
3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。
4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。
2.
1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。
2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。 1） 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。
2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。
3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。
4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色
5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。
原位杂交中溶液的配制：
PBS:
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 调PH值至7.4
抽滤，灭菌
4% 多聚甲醛：
多聚甲醛 40g
PBS 1L
加热持续搅拌至溶液澄清。-20℃保存
PBST：
PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。
20XSSC:
Na3Citrate 2H2O 88.2g
NaCl 175.5g
DEPC H2O 至1L
抽滤，灭菌
SSCT：
SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。
HYB-：
甲酰胺：20XSSC储液：DEPC水=2：1：1配制
加入Tween-20使其终浓度为0.1%，-20c保存。
HYB+：
HYB- 20ml
yeast RNA 10mg
heparin 1mg。
-20℃保存。
MAB：
maleic acid 11.6g
NaCl 8.8g
用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.5
4℃保存
MABT
MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.
10% blocking reagent:
blocking reagent 8g
MAB 72ml
1：2：7溶液：
灭活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7
用时现配
Staining buffer：
Tris 12.1g
pH9.5
Mgcl 6H2O 10.2g,
Nacl 5.85g
Tween-20 1ml,
用之前加1M的左旋咪唑储液，使之终浓度为1mM。
质谱流式---质谱技术和流式技术的完美结合
CyTOF 质谱流式细胞仪利用重金属同位素作为抗体标签，利用质谱技术对细胞蛋白进行定量检测。
该技术的应用一方面使流式检测通道数量大幅提高到了上百个，提升了从单个样品获得的信息量；另一方面避免了通道间信号的干扰，大大简化了实验设计，提升了数据的可靠性。
通道的增加意味着可以对细胞亚型进行更精准的分群，也意味着可以对细胞内信号通路进行更加全面的分析；单次实验可捕获百万级别的单细胞，避免遗漏小亚群。广度和深度的综合，
使得质谱流式成为单细胞水平蛋白组学研究不可或缺的工具。
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Helios 质谱流式系统对信号分辨率极高，可同时检测上百种不同的标签。质谱流式可以同时获得单细胞表面 Marker、胞内信号通路、转录因子、细胞因子、细胞周期等等各方面的信 息，在造血、免疫、干细胞、癌症以及药物筛选等多个领域的研究中有着广泛的应用。
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从抗体 Panel 设计到数据分析，每一步都经过科学、缜密的设计，以保障高质量研究成果。
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常见问题
Q
（2）检测系统的不同：前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段，而后者使用 ICP 质谱技术作为检测手段。
Q
（2）通道间无干扰，无需计算补偿。
（3）采用独特的金属标签抗体。由于细胞本身不含这些作为标签的金属元素，没有传统流式的“自发荧光”，因此信号背景极低。
（4）多样化的数据处理方式，实现对样品的深入分析。
Q
（1）PBMC 细胞分离。推荐用肝素或者柠檬酸盐作为抗凝剂抽提全血，并在4小时内使用Ficoll 或者 Percol 密度梯度离心法分离出 PBMC。注意需要尽量去除红细胞；
（2）顺铂染色。顺铂可用于区分死活细胞，推荐加入1 uL 终浓度为5 uM 的顺铂，37℃孵育5分钟后加入2~5倍体积的 Cell Staining Buffer，中止反应。其后以300 g的转速离心5分钟， 弃上清后使用 Cell Staining Buffer 或细胞培养基重悬细胞；
（3）细胞刺激（可选）。将细胞转入培养箱培养15~30 min，随后使用相应刺激物进行分组刺激。刺激后的细胞转至离心管，离心后使用 Cell Staining Buffer 稀释至1 mL； 注：此步根据具体需要，短时间的信号通路刺激可以按上述步骤进行；如果做数小时的胞内 Cytokine，该步骤应该放在染顺铂之前。
（4）细胞固定。使用2× 的 fixation buffer（含3.2% PFA 的 PBS）进行固定；
（5）将固定后的样品保存在-80℃。
Targeting YAP-Dependent MDSC Infiltration Impairs Tumor Progression
期刊: Cancer Discovery
影响因子:19.45
发表单位：德克萨斯大学安德森癌症中心
发表时间: 2016年1月
研究背景
对前列腺癌细胞和肿瘤浸润免疫细胞之间信号传导机制的研究可能会开启新的治疗方法。
三、研究结果
1. 通过质谱流式细胞分析技术对17个表面 Marker 进行分析，解析了肿瘤组织中免疫细胞的亚群组成及其随时间的变化趋势。
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图1 组间平均 beta 值差异火山图
2. 红色代表的是骨髓来源的抑制性细胞（MDSC），可以看到其比例随时间明显增大，提示 MDSC 在肿瘤发生过程中具有重要的作用。
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研究结论
本研究通过质谱流式对 PTEN 和 Smad4 缺失的前列腺癌模型进行研究，发现肿瘤浸润免疫细胞主要由 MDSC 组成，且其比例随着癌症的发展不断增高。如果将此部分细胞剔除，病程会 受到抑制。
阅读原文：
首先将表型类似的细胞聚成小群，然后依照各小群的表型相似度进行聚类分析，最后得到一个树形图。
每个节点都是由一群表型相似的细胞构成的，节点相对位置不同也体现了其表型的差异。
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尽可能保持信息不丢失的基础上，将多维信息压缩到二维，这样就可以用二维散点图来展示高维数据的结构。
可以看出，在 viSNE 图谱中，几个主要免疫亚群各自聚群。
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Wanderlust 会根据每个细胞排列的位置赋予细胞一个 Wanderlust 值，其大小就反映了分化程度。
以 B 细胞为例，0代表起点（造血干细胞），1代表终点（Immature Naive B），该数值越小说明细胞越原始。
有了这个工具，我们可以观察 B 细胞分化过程中任意一个蛋白的表达变化，这些信息可以帮助我们找到分化过程中一些重要的事件。
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将不同时间点的质谱流式数据做降维分析，得到的图谱反映了细胞表型随时间的变化。
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临床样本具有很大的异质性，比较有规律性、代表性的差别往往只存在于少数亚群中。Citrus 可分析识别出这些特征性亚群。
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聚类热图可以简单地聚合大量数据，直观地展现数据的频率高低。
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用来呈现数据点的分布，表现两个元素的相关性。
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原文： CyTOF -result
Ki-67与BrdU染色的区别
Ki-67几乎在所有类型的细胞都有表达，通常在细胞周期的活跃期（G1，S，G2，M）可以检测到，而在静止期（G0）检测不到。通过Ki-67染色，研究人员可以评估处于细胞周期所有活跃期的总增殖细胞的百分比。科研人员可以借此观察药物或未知化合物的刺激效应或抗增殖效应。
与Ki-67染色不同，BrdU染色只检测处于S期细胞，即处于DNA复制期的细胞。BrdU是尿嘧啶核苷的衍生物，当加入到培养的细胞中时，将取代胸腺嘧啶核苷整合入S期细胞的DNA中。染色过程中，DNA必须使用DNase I降解，这对染色成功与否是非常关键的。然后用抗BrdU抗体进行染色，以鉴定BrdU整合入增殖的S期细胞。对于使用传统的[3H]胸腺嘧啶核苷整合的方法评估细胞增殖的客户而言，BrdU染色是一项很有优势的替代方法。BrdU染色可以帮助客户确定刺激剂或增殖诱导处理所引发的进入S增殖期细胞。
BrdU的相关产品信息。
染色缓冲液试剂盒 vs 独立的Anti-BrdU 抗体:
BrdU染色试剂盒在检测细胞增殖时（不能用于细胞周期分析）为研究者提供全部所需的试剂，试剂盒中包含：Anti-BrdU antibody、ready-to-use BrdU、DNase I和用于BrdU染色而特异设计的优化缓冲液。BrdU 染色试剂盒有以下优点：
1 整个染色过程可在室温下进行；
2 染色时间少于3个小时；
3 结果稳定，重复性好；
4 试剂盒中的Anti-BrdU antibodies可单独使用。
增殖与转录因子染色:
Anti-BrdU antibodies能和Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Cat# 00-5523)一起使用吗？
此问题要依据具体情况而定，缓冲液的选择要根据Anti-BrdU 抗体的荧光标记来选择，除了eFluor 450，在Anti-BrdU antibodies说明书中都提供了用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set进行染色的方案。对于eFluor? 450荧光标记的Anti-BrdU antibody，染色时一定要选择BrdU Staining Buffer Set (Cat# 00-5525)，我们的网站上也提供了其染色方案。
小贴士： BrdU Staining Buffer能够用于许多细胞因子和转录因子的流式染色。
使用Foxp3/TF buffer和BrdU buffer进行流式染色的比较
求助流式staining buffer 的配方
应用流式细胞仪协议的共轭二抗胞内染色 A解决方案和试剂 1.1倍，磷酸盐缓冲液（PBS）：溶解8克氯化钠，氯化钾0.2克，1.44 gNa2HPO4and0.24克KH2PO4in 800毫升蒸馏水（dH2O）。调整在室温下用HCl和1 liter.Store量pH值to7.4 。 2.Formaldehyde（